和很多伟大的科学发明一样,双光子显微镜的出现也有一点偶然,但正是那瞬间的灵感为生物科学尤其是神经科学带来了一种**性的成像技术:双光子激发荧光显微镜。
1990年初,当Winfried Denk刚从康奈尔大学博士毕业准备前往瑞士读博后时,他看了一本关于激光扫描显微镜的书,从中了解到非线性光学效应——强光和物质的相互作用。当时,Denk有同事研究生物样品中的钙离子但苦于没有强大的紫外激光器和光学元件,于是他就想到如果使用双光子吸收就能够绕开紫外,换言之,与其通过一个紫外光子激发标记的钙离子,通过两个双倍波长的可见光光子也能激发相同的荧光。 双光子显微镜使用的是可见光或近红外光作为光源;国内2PPLUS双光子显微镜

而配合了双光子激发技术,激光共聚扫描显微镜则能更好得发挥功效。那么,什么是双光子激发技术呢?在高光子密度的情况下,荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子使电子跃迁到较高能级,经过一个很短的时间后,电子再跃迁回低能级同时放出一个波长为长波长一半的光子(P=h/λ)。利用这个原理,便诞生了双光子激发技术。双光子显微镜使用长波长脉冲激光,通过物镜汇聚,由于双光子激发需要很高的光子密度,而物镜焦点处的光子密度是比较高的,所以只有在焦点处才能发生双光子激发,产生荧光,该点产生的荧光再穿过物镜,被光探头接收,从而达到逐点扫描的效果。
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王爱民副教授结合工作实例,展示了双光子显微镜的研发与应用。历经3年多的协同奋战,成功研制新一代高速分辨微型化双光子荧光显微镜,重量只为2.2克,这一微型显微镜获取了小鼠在自由行为过程中大脑神经元和神经突触活动清晰、稳定的图像,该显微镜适于佩戴在小动物头部,可实时记录数十个神经元、上千个神经突触的动态信号,在大型动物上,还可望实现多探头佩戴、多颅窗不同脑区的长时程观测。双光子显微成像的在生物医学研究和医疗领域应用有较大的应用前景,首先双光子显微镜能够进行细胞和组织结构成像,在亚微米级成像,此功能与目前市场上的共聚焦类显微镜性能类似;双光子显微成像能够实时、在体、原位、无创地,根据不同物质组份的光谱特性,区分成像;双光子显微镜能够进行生化指标成像,在无造影剂的前提下,利用自发荧光、二次谐波、荧光获得活细胞生化信息。
相比普通的显微镜电子显微镜可以观察尺度更小的东西,冷冻电镜更是可以观察有活性的生物大分子,而双光子显微镜有什么优势呢?它能做到什么普通光学显微镜做不到的事情吗?原来,双光子显微镜可以精确穿透较厚标本进行定点、***观察!
由于电磁波的波长越短,粒子性越强,受散射影响也就越大。双光子显微镜将激发光源改为长波长激光,在增加了激光的穿透性的同时还减少了对细胞的毒性。除此之外,因为只有物镜焦点处能发生双光子激发效应,所以扫描的精确度极高,也能提高激发光效率,减少被扫描点之外的荧光物质消耗。 双光子显微镜的应用中,该如何选择以及更好的使用PMT。

双光子显微成像的在生物医学研究和医疗领域应用有较大的应用前景,首先双光子显微镜能够进行细胞和组织结构成像,在亚微米级成像,此功能与目前市场上的共聚焦类显微镜性能类似;双光子显微成像能够实时、在体、原位、无创地,根据不同物质组份的光谱特性,区分成像;双光子显微镜能够进行生化指标成像,在无造影剂的前提下,利用自发荧光、二次谐波、荧光获得活细胞生化信息。双光子显微镜技术在医疗诊断应用中具有巨大的潜力,该领域还未形成标准和体系,需要系统的医学研究与庞大的医疗数据加以支撑,通过研究人体基于多光子成像技术,进行细胞结构、生化成分、微环境、组织形态、代谢功能的影响信息,找到与疾病的细胞学、分子生物学、组织病理学、诊断和***特征的关联关系,共同探究生理病理基础和分子细胞生物学机制,筛选鉴定**、皮肤病、自身免疫病及其他疑难疾病的诊断及鉴别诊断依据,建立全新的多光子细胞诊断的完整数据库,定义出针对不同疾病的多光子临床检测设备的产品标准。双光子显微镜有哪些分类呢?国外ultima双光子显微镜成像原理是什么
双光子显微镜已延伸到各个领域研究中,它能对样品进行三维观察;国内2PPLUS双光子显微镜
双光子显微镜是结合了双光子激发技术和激光扫描共聚显微镜的一种新型荧光显微镜,其原理大致是这样的:
首先,让我们来看看什么是荧光显微镜。荧光显微镜是以紫外线为光源,照射被检物体上的荧光物质或是荧光染料,使其发出荧光。相比普通光学显微镜,荧光显微镜运用了波长更短的紫外线,再将可见光过滤掉,提高了分辨力率。而当被检物体过厚时,从不同深度发出的荧光都会打在物镜上,使观察到的像模糊、发虚,无法清楚的知道被检物体的结构。而激光扫描共聚显微镜就是在荧光显微镜的基础上,增加了激光扫描装置,从而解决了上述问题。
激光共聚扫描显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式,采用激光束作光源,激光束经照明孔,经由分光镜反射至物镜,并聚焦于样品上,对标本焦平面上每一点进行扫描。组织样品中的荧光物质受到刺激后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜,通过探测孔时先聚焦,然后被光探头收集,转化为信号输送到计算机进行处理。这个装置能让通过探测***的只有焦平面上发出的荧光,使成像更为清晰准确,同时通过改变物镜的焦距,能对不同焦平面进行扫描,通过计算机绘出普通显微镜无法观测的三维图像。
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