而配合了双光子激发技术，激光共聚扫描显微镜则能更好得发挥功效。那么，什么是双光子激发技术呢？在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子使电子跃迁到较高能级，经过一个很短的时间后，电子再跃迁回低能级同时放出一个波长为长波长一半的光子（P=h/λ）。利用这个原理，便诞生了双光子激发技术。双光子显微镜使用长波长脉冲激光，通过物镜汇聚，由于双光子激发需要很高的光子密度，而物镜焦点处的光子密度是比较高的，所以只有在焦点处才能发生双光子激发，产生荧光，该点产生的荧光再穿过物镜，被光探头接收，从而达到逐点扫描的效果。
双光子显微镜成像技术及不同转基因小鼠开展对多种脏器的成像研究。激光双光子显微镜光损伤
2020年12月22日，临研所、病理科和科研处邀请北京大学王爱民副教授做了题目为“新一代微型双光子显微成像系统介绍及其在临床医疗诊断”的学术报告。学术报告由临研所医学实验研究平台潘琳老师主持。王爱民，北京大学信息科学技术学院副教授，毕业于北京大学物理系，获学士、硕士学位，后于英国巴斯大学物理系获博士学位。该研究组研发的微型双光子显微镜，第1次在国际上获得了小鼠大脑神经元和神经突触清晰稳定的动态信号，该成果获得了2017年度“中国光学进展”和“中国科学进展”，并被Nature Methods评为2018年度“年度方法--无限制行为动物成像”。目前，该研究组正在研究新一代双光子显微成像技术在临床诊断中的应用，为未来即时病理、离体组织检测、术中诊断等提供新的影像手段和分析方法。 进口荧光激光双光子显微镜荧光寿命计数上海双光子显微镜就找因斯蔻浦。
在传统宽场显微镜中，来自标本不同纵深的光线都可投射到同一焦平面（感光元件）上，所以其成像是整个样品的重叠像，没有纵向分辨能力。单光子激光共聚焦显微镜用***有效滤除了杂散光，分辨率有了本质上的提高，拥有了对样品的特定焦平面精细成像的能力，可以进行三维成像、动态成像等。然而，***在滤除杂散光的同时也将大部分来自焦平面的荧光滤除了，只有很弱的荧光到达检测器。若要提高信号强度，需要加大激发光功率，这又会导致对活细胞的光毒性和荧光分子的光漂白增加。双光子显微镜比较大的优势来源于其双光子光源的非线性光学效应，与单光子共聚焦显微镜比较大的不同在于无须使用***限制光学散射，其具体优势如下。
通过对微型光学系统的重新设计，FHIRM-TPM 2.0成像视野扩大至420×420平方微米，微型物镜的工作距离扩展至1毫米，以实现非侵入式成像；嵌入了可拆卸的快速轴向扫描模块，实现了180微米深度的三维体成像和多平面快速切换的实时成像。该模块由一个快速的电动变焦透镜和一对中继透镜组成，在不同深度成像时保持放大倍率恒定。其中，变焦模块重量1.8克，研究人员可根据实验需求自由拆卸。此外，新版微型化成像探头还可整体即时拔插，极大地简化了实验操作，避免了长周期实验时对动物的干扰。在重复装卸探头追踪同一批神经元时，视场旋转角小于0.07弧度，边界偏差小于35微米。用双光子显微镜看看你的皮肤有没有重焕新生；
在深度组织中以较长时间对活细胞成像，双光子显微镜是当前之选。双光子和共聚焦显微镜都是通过激光激发样品中的荧光标记，使用探测器测量被激发的荧光。但是，共聚焦一般使用单模光纤耦合激光器，通过单光子激发荧光，而双光子使用飞秒激光器，通过几乎同时吸收两个长波光子激发荧光。下面是两种技术的对比图。双光子激发荧光的主要优势：双光子比共聚焦使用的更长的波长，所以对组织的损伤更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般为100微米，双光子则能达到250到500微米，甚至超过1毫米。另外，同时吸收两个光子意味只有较强度聚焦点处能被激发，所以不会损伤焦平面之外的组织，并且生成更清晰的图像。双光子显微镜已成为较厚有生命体生物组织三维成像中不可或缺的工具。国内2PPLUS双光子显微镜扫描深度
双光子显微镜使用方法是什么？激光双光子显微镜光损伤
Denk很快就将双光子显微镜用于神经元成像，而1997年在Svoboda测量完整老鼠大脑的锥体神经元的感官刺激诱导树突钙离子动态后，双光子显微镜的潜能开始完全凸显。值得一提的是，霍华德·休斯医学院Svoboda实验室和Thorlabs在2016年合作推出了一种强大的多光子介观显微镜，其成像视场达到5毫米，能够跨多个脑区进行高速功能成像。根据清华大学单一采购来源的**指导意见：这种显微镜的视场是普通双光子显微镜的10倍。30年来，双光子显微镜已成为较厚生物组织三维成像中不可或缺的工具。从双光子到三光子甚至四光子，这种非线性成像技术通常也被统称为多光子显微镜。自1990年以来每年发表的多光子显微镜文章数量，发展速度可见一斑。激光双光子显微镜光损伤
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