双光子显微成像技术不是什么新技术，早在20多年前就有了，目前已经在生命科学和材料科学中广泛应用。几年前双光子过期后，已经推出自己的双光子显微镜的厂家估计不少于10家以上。即便如此，世界上很多实验室都搭双光子，自己搭的好处有很多，首先是便宜，尤其是实验室已经有飞秒激光器，那就更很省钱了。其次是灵活，可以选择针对特殊用途的搭配，改动也灵活。好处就是可以锻炼队伍，一趟走下来可以把新手带出来，后期维护也更加自由。当然坏处也不少，首先是操心，特别是第1次搭的时候，开始要想方案，后来要解决各种实际问题。其次是花时间，加上买配件的时间，比买一台现成的商业化双光子耗时长。
现在已经有不少关于如何搭双光子显微镜的文章，各种protocol，大多是老外写的，中文的较少。其实完全自己搭一套好用的系统还是不容易的，尤其是没有经验的时候，容易走弯路，多花钱，也多花时间，再加上双光子的重要器件都需要从国外购买，在国内买这些东西耗时较长。因此，我想总结一下我们的经验，贴出来分享，希望能帮到想自己动手的实验室， 双光子显微镜放大倍数是多少？进口布鲁克双光子显微镜原理
双光子技术在医疗诊断应用中具有巨大的潜力，该领域还未形成标准和体系，需要系统的医学研究与庞大的医疗数据加以支撑，通过研究人体基于多光子成像技术，进行细胞结构、生化成分、微环境、组织形态、代谢功能的影响信息，找到与疾病的细胞学、分子生物学、组织病理学、诊断和特征的关联关系，共同探究生理病理基础和分子细胞生物学机制，筛选鉴定、皮肤病、自身免疫病及其他疑难疾病的诊断及鉴别诊断依据，建立全新的多光子细胞诊断的完整数据库，定义出针对不同疾病的多光子临床检测设备的产品标准。讨论环节，来自病理科、呼吸中心、心脏科、神经科、皮肤科及研究所的多位医师及研究人员纷纷结合各自的工作领域与王爱民副教授展开了热烈的讨论，其中毛发中心杨顶权主任计划再次邀请王爱民副教授进行学术交流。通过本次学术交流，病理科与研究所分别与王爱民副教授课题组达成了初步合作意向。
国外bruker双光子显微镜成像技术双光子显微镜比单光子共聚焦显微镜较大的不同在于无须使用孔限制光学散射；
双光子显微镜为什么穿透能力强？生物组织在近红外波段存在两个窗口,第1个近红外窗口对应波长在700nm-900nm,第2个近红外窗口对应波长在1000nm-1400nm之间。举例说明就是单晶硅对于可见光几乎是不透明的，但是对于红外波段就像是“水晶”一样通透性很好了。原因有两点：
1.生物组织对红外光的吸收弱，对可见光吸收强。类似的，平时用手电筒照射手指，会看到手通透红亮，也是由于生物组织对长波长的红光吸收少。
2.生物组织对红外光的散射弱。因为瑞利散射的强度反比于波长λ的四次方。类似的，早晨的太阳非常红，也就是因为长波长的红光穿透力更强。
这两点共同导致长波长的红外光比可见光对生物组织的穿透能力强。
双光子显微镜的优势：在深度组织中以较长时间对活细胞成像，双光子显微镜是当前之选。双光子和共聚焦显微镜都是通过激光激发样品中的荧光标记，使用探测器测量被激发的荧光。但是，共聚焦一般使用单模光纤耦合激光器，通过单光子激发荧光，而双光子使用飞秒激光器，通过几乎同时吸收两个长波光子激发荧光。下面是两种技术的对比图。双光子激发荧光的主要优势：双光子比共聚焦使用的更长的波长，所以对组织的损伤更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般为100微米，双光子则能达到250到500微米，甚至超过1毫米。另外，同时吸收两个光子意味只有较强度聚焦点处能被激发，所以不会损伤焦平面之外的组织，并且生成更清晰的图像。 双光子显微镜的性能得到不断地优化，结合它的特点，大致可以分成深和活两个方面的提升。
在深度组织中以较长时间对活细胞成像，双光子显微镜是当前之选。双光子和共聚焦显微镜都是通过激光激发样品中的荧光标记，使用探测器测量被激发的荧光。但是，共聚焦一般使用单模光纤耦合激光器，通过单光子激发荧光，而双光子使用飞秒激光器，通过几乎同时吸收两个长波光子激发荧光。下面是两种技术的对比图。双光子激发荧光的主要优势：双光子比共聚焦使用的更长的波长，所以对组织的损伤更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般为100微米，双光子则能达到250到500微米，甚至超过1毫米。另外，同时吸收两个光子意味只有较强度聚焦点处能被激发，所以不会损伤焦平面之外的组织，并且生成更清晰的图像。双光子显微镜在组织透明化成像中应用；ultimainvestigator双光子显微镜多少钱
双光子显微镜非常适合对细胞组织进行长时间在体成像。进口布鲁克双光子显微镜原理
随着技术的发展，双光子显微镜的性能得到不断地优化，结合它的特点，大致可以分成深和活两个方面的提升。
深要想让激发激光进入更深的层面，大致可从两个方面入手，装置优化与标本改造。
关于装置优化，我们可以把激光束变得更细，使能量更加集中，就能让激光穿透更深。
关于标本，其中影响光传播的主要是物质吸收和散射，解决这个问题，我们需要对样本进行透明化处理。一种方法是运用某种物质将标本浸泡，使其中的物质（主要是脂质）被破坏或溶解。另一种方法是运用电泳将脂质电解，让标本“透明度”提高。高光子密度带来的高能量容易损伤细胞，所以双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲达到最大值所持续的周期只有十万亿分之一秒，而其频率可以达到80至100兆赫，这样即能达到双光子激发的高光子密度要求，又能不损伤细胞，使扫描能更好地进行。
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