目前，世界各国的脑科学研究如火如荼，中国的脑计划也即将启动。其中，关于全景式解析脑连接图谱和功能动态图谱的研究成为重点研究方向，而如何打破尺度壁垒，融合微观神经元和神经突触活动与大脑整体的信息处理和个体行为信息，是领域内亟待解决的一个关键挑战。
2021年1月6日，由北京大学分子医学研究所牵头，联合北大信息科学技术学院电子学系、工学院以及中国人民******医学科学院等组成的跨学科团队，在Nature Methods在线发表题为 “Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane, and long-term brain imaging”的文章。文中报道了第二代微型化双光子荧光显微镜FHIRM-TPM 2.0，其成像视野是该团队于2017年发布的低1代微型化显微镜的7.8倍，同时具备三维成像能力，获取了小鼠在自由运动行为中大脑三维区域内上千个神经元清晰稳定的动态功能图像，并且实现了针对同一批神经元长达一个月的追踪记录。 双光子显微镜大量运营在实验室当中；国外激光双光子显微镜成像视野
TOPTICA FemtoFiber ultra 920超快光纤激光器是一种易于操作且无需维护的激光系统。其输出波长为920 nm，非常适合常规荧光基团（如GFP，eGFP，Eosin，GCaMP，CFP，Calcein 或者Venus）的双光子激发。能给荧光基团提供比较高的峰值功率，常用于神经科学和其他与激光有关的生物光子学学科。而且其独特设计（制造简单且经济高效的光源）对双光子荧光显微镜发展的革新具有潜在的可能。在双光子显微镜中，峰值功率就是亮度！如果您希望获得比较好的图像亮度，那么你就需要短脉冲，高功率，较重要的是需要干净的时间脉冲形状。FemtoFiber ultra 920具有足够高的输出功率，较短的脉冲和独特的Clean-Pulse技术，以及具有相对比较高的峰值功率，使得其在双光子显微镜中可以实现****的亮度，而不会对样品造成不必要的加热。FemtoFiber ultra 920交钥匙，完全集成的色散补偿（可确保样品处的脉冲较短），内置的功率控制，操作直观以及其坚固而紧凑的设计，使该系统具有极为友好的用户体验，是非线性显微镜应用的较好解决方案。例如荧光蛋白的双光子激发和基于SHG的对比机制。美国激光双光子显微镜用途双光子显微镜观察到的现象证明了钙离子的增加依赖于肌体触发的钠离子作用电势。
双光子显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。
双（多）光子成像优势在于，具有更深的组织穿透深度，利用红外光，能够在层面检测极限达1mm的组织区域；因信号背景比高，而具有更高的对比度；因激发体积小，具有定点激发的特性，具有更少的光毒性；激发波长由紫外、可见光调整为红外激发，能够更加安全。
参考维基百科 Near-infrared window in biological tissue，生物组织在近红外波段存在两个窗口,第1个近红外窗口对应波长在700nm-900nm,第二个近红外窗口对应波长在1000nm-1400nm之间。举例说明就是单晶硅对于可见光几乎是不透明的，但是对于红外波段就像是“水晶”一样通透性很好了。
因为组织对可见光区域的较强吸收和散射带来两个严重的问题
第1个是激发光的减弱，
第二个就是另外就是由于物镜本身光的光学特性，单光子激发的背景较强，所以才有共聚焦系统提高成像的分辨率；
刚好双光子在这两点具有很大的优势上面的内容基本在谈到双光子优势都会相对说明，
在实际操作中成像的深度和样品的关系很大，
双光子成像利用高亮度的荧光标记材料，已经有做到mm级别的穿透深度
双光子显微镜角膜成像；
随着技术的发展，双光子显微镜的性能得到不断地优化，结合它的特点，大致可以分成深和活两个方面的提升。
深要想让激发激光进入更深的层面，大致可从两个方面入手，装置优化与标本改造。
关于装置优化，我们可以把激光束变得更细，使能量更加集中，就能让激光穿透更深。
关于标本，其中影响光传播的主要是物质吸收和散射，解决这个问题，我们需要对样本进行透明化处理。一种方法是运用某种物质将标本浸泡，使其中的物质（主要是脂质）被破坏或溶解。另一种方法是运用电泳将脂质电解，让标本“透明度”提高。高光子密度带来的高能量容易损伤细胞，所以双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲达到最大值所持续的周期只有十万亿分之一秒，而其频率可以达到80至100兆赫，这样即能达到双光子激发的高光子密度要求，又能不损伤细胞，使扫描能更好地进行。
双光子显微镜可以在小鼠的的任何部位进行有生命体成像。ultima2PPLUS双光子显微镜商家电话
双光子显微镜可以用于局部微蚀镭射磨皮后的胶原重塑的检测。国外激光双光子显微镜成像视野
2020年12月22日，临研所、病理科和科研处邀请北京大学王爱民副教授做了题目为“新一代微型双光子显微成像系统介绍及其在临床医疗诊断”的学术报告。学术报告由临研所医学实验研究平台潘琳老师主持。王爱民，北京大学信息科学技术学院副教授，毕业于北京大学物理系，获学士、硕士学位，后于英国巴斯大学物理系获博士学位。该研究组研发的微型双光子显微镜，第1次在国际上获得了小鼠大脑神经元和神经突触清晰稳定的动态信号，该成果获得了2017年度“中国光学进展”和“中国科学进展”，并被Nature Methods评为2018年度“年度方法--无限制行为动物成像”。目前，该研究组正在研究新一代双光子显微成像技术在临床诊断中的应用，为未来即时病理、离体组织检测、术中诊断等提供新的影像手段和分析方法。 国外激光双光子显微镜成像视野
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