双光子显微成像技术不是什么新技术，早在20多年前就有了，目前已经在生命科学和材料科学中广泛应用。几年前双光子过期后，已经推出自己的双光子显微镜的厂家估计不少于10家以上。即便如此，世界上很多实验室都搭双光子，自己搭的好处有很多，首先是便宜，尤其是实验室已经有飞秒激光器，那就更很省钱了。其次是灵活，可以选择针对特殊用途的搭配，改动也灵活。好处就是可以锻炼队伍，一趟走下来可以把新手带出来，后期维护也更加自由。当然坏处也不少，首先是操心，特别是第1次搭的时候，开始要想方案，后来要解决各种实际问题。其次是花时间，加上买配件的时间，比买一台现成的商业化双光子耗时长。现在已经有不少关于如何搭双光子显微镜的文章，各种protocol，大多是老外写的，中文的较少。其实完全自己搭一套好用的系统还是不容易的，尤其是没有经验的时候，容易走弯路，多花钱，也多花时间，再加上双光子的重要器件都需要从国外购买，在国内买这些东西耗时较长。因此，我想总结一下我们的经验，贴出来分享，希望能帮到想自己动手的实验室，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲器。布鲁克双光子显微镜图像对比度
1.生物组织对红外光的吸收弱，对可见光吸收强。类似的，平时用手电筒照射手指，会看到手通透红亮，也是由于生物组织对长波长的红光吸收少。2.生物组织对红外光的散射弱。因为瑞利散射的强度反比于波长λ的四次方。类似的，早晨的太阳非常红，也就是因为长波长的红光穿透力更强。这两点共同导致长波长的红外光比可见光对生物组织的穿透能力强。与单光子显微镜（如共聚焦显微镜）相比，双光子显微镜可以使用约二倍波长的激光去激发荧光团。长波长光束散射程度低(RayleighScattering)，所以穿透能力强。国内激光荧光双光子显微镜供应商双光子显微镜大量运营在实验室当中。
微型化双光子荧光显微成像改变了在自由活动动物中观察细胞和亚细胞结构的方式，可用于在动物觅食、哺乳、跳台、打斗、嬉戏、睡眠等自然行为条件下，或者在学习前、学习中和学习后，长时程观察神经突触、神经元、神经网络、远程连接的脑区等多尺度、多层次动态变化。该成果在2016年底美国神经科学年会、2017年5月冷泉港亚洲脑科学专题会议上报告后，得到包括多位诺贝尔奖获得者在内的国内外神经科学家的高度赞誉。冷泉港亚洲脑科学专题会议、美国明显神经科学家加州大学洛杉矶分校的Alcino J Silva教授在评述中写道，“从任何一个标准来看，这款显微镜都了一项重大技术发明，必将改变我们在自由活动动物中观察细胞和亚细胞结构的方式。它所开启的大门，甚至超越了神经元和树突成像。系统神经生物学正在进入一个新的时代，即通过对细胞群体中可辨识的细胞和亚细胞结构的复杂生物学事件进行成像观测，从而更加深刻地理解进化所造就的大脑环路实现复杂行为的重要工程学原理。毫无疑问，这项非凡的发明让我们向着这一目标迈进了一步。”
从双光子到三光子：科学家正在从双光子转向三光子显微镜。1996年，ChrisXu在康奈尔大学(Denk同导师实验室)读博期间发明了三光子显微镜，如果双光子吸收可行，那么三光子看起来也是自然的发展方向。三光子成像使用更长的波长，大约在1.3和1.7微米，其成像深度也比双光子更深，目前记录约为2.2毫米，人类大脑皮层厚约4毫米。相比双光子显微镜，三光子还要求以较低重频使用更强和更短的激光脉冲，而传统的钛宝石激光器难以达到这些要求，但是对于掺镱光纤飞秒光参量放大器则非常容易，比如我们的Y-Fi光参量放大器(OPA)。双光子显微镜能够进行光裂解、光转染和光损伤等光学操纵。
临研所、病理科和科研处邀请北京大学王爱民副教授在2020年12月22日做了题目为“新一代微型双光子显微成像系统介绍及其在临床医疗诊断”的学术报告。学术报告由临研所医学实验研究平台潘琳老师主持。王爱民，北京大学信息科学技术学院副教授，毕业于北京大学物理系，获学士、硕士学位，后于英国巴斯大学物理系获博士学位。该研究组研发的微型双光子显微镜，第1次在国际上获得了小鼠大脑神经元和神经突触清晰稳定的动态信号，该成果获得了2017年度“中国光学进展”和“中国科学进展”，并被Nature Methods评为2018年度“年度方法--无限制行为动物成像”。目前，该研究组正在研究新一代双光子显微成像技术在临床诊断中的应用，为未来即时病理、离体组织检测、术中诊断等提供新的影像手段和分析方法。双光子显微镜是新型的荧光显微镜，其原理大致是这样的；国内荧光双光子显微镜价格
双光子显微镜是结合了双光子激发技术和激光扫描共聚显微镜。布鲁克双光子显微镜图像对比度
双光子吸收理论早在1931年就由诺奖得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因为有了激光才得到实验验证，但是到WinfriedDenk发明双光子显微镜又用了将近30年。要理解双光子的技术挑战和飞秒激光发挥的重要作用，首先要了解其中的非线性过程。双光子吸收相当于和频产生非线性过程，这要求极高的电场强度，而电场取决于聚焦光斑大小和激光脉宽。聚焦光斑越小，脉宽越窄，双光子吸收效率越高。对于衍射极限显微镜，聚焦在样品上的光斑大小只和物镜NA和激光波长有关，所以关键变量只剩下激光脉宽。基于以上分析，能够以高重频(100MHz)输出超短脉冲(100fs量级)的飞秒激光器成了双光子显微镜的标准激发光源。这也再次说明双光子显微镜的优势：只有焦平面处才能形成双光子吸收，而焦平面之外由于光强低无法被激发，所以双光子成像更清晰。布鲁克双光子显微镜图像对比度
